НОВОФАРМА: Главная / О компании / Технологии / Продукция / Маркетинг / Горячая линия / Контакты / Новости / Novopharma InfoPlus / Форум


Антимутагенная активность

В настоящее время проблема поиска и создания препаратов, обладающих антимутагенным действием, приобретает особую остроту.
Это связано с тем, что в больших масштабах происходит загрязнение окружающей среды химическими веществами антропогенного происхождения, при этом некоторые из них обладают в разной степени мутагенным и канцерогенным действием. Кроме того, в медицине используются противораковые лекарственные препараты и физические
воздействия, побочным эффектом которых может быть индукция мутаций в половых и соматических клетках пациентов.
Проблема разработки антимутагенных препаратов сильно затруднена отсутствием быстрых и надежных методов оценки мутагенной и особенно антимутагенной активности исследуемых препаратов. Возникновение мутаций - редкое событие, поэтому для надежного определения частоты индуцированных мутаций необходимо анализировать потомки сотен тысяч мутагенизированных клеток. В связи с этим необходимо иметь тест-системы высоко чувствительные к мутагенному действию различных веществ. Такие системы созданы в ПИЯФ РАН и включают штаммы, несущие уникальный набор мутаций, позволяющий с высокой чувствительностью и точностью определять степень генетической опасности исследуемых веществ.
В лаборатории генетики эукариот ПИЯФ РАН был произведен анализ антимутагенного действия препарата Гептронг.
Анализ проводился на базе тест-системы С3.


МЕТОДИКА.
Тестерная линия дрожжей Saccharomyces cerevisiae 3С-SVK-180,генотипа MATa ade2-248 leu2 rad2 hsm3. Ген МАТ контролирует ПОЛ клетки, мутантный ген ade2-248 блокирует биосинтез нуклеиновых кислот, мутантный ген leu2 блокирует синтез аминокислоты лейцина, мутантный ген rad2 приводит к высокой чувствительности клетки к ультрафиолетовым лучам и ряду химических мутагенов, мутантный ген hsm3 повышает уровень индуцированных мутаций.
Генотип созданной тестерной линии позволяет учитывать возникновение прямых мутаций в 5 генах, контролирующих биосинтез аденина, предшественника биосинтеза нуклеиновых кислот. Разрушенный ген ade2 придает колониям дрожжевых клеток красную окраску, а мутация в одном из 5 вышеупомянутых генов изменяет окраску колоний на белую. По появлению белых колоний мутантов судят об интенсивности мутагенеза. Мутации rad2 и hsm3 в сотни раз повышают чувствительность клеток дрожжей к мутагенному и летальному действию различных химических и физических мутагенов. Перечисленные выше свойства тестерной линии позволяют с наименьшими затратами учитывать такое редкое событие как возникновение мутации в определенном гене.
Питательная среда для выращивания тестерных культур. Основная среда, использованная в данной работе, имела следующий состав: глюкоза - 2 г/л, этиловый спирт - 20 мл/л, КН2РО4 - 2 г/л,Мg2SО4 - 1 г/л, (NН4)2SО4 - 1 г/л, дрожжевой автолизат - 2 г/л,пептон - 2 г/л, агар-агар 30 г/л.
Метод культивирования. Перед началом экспериментов культура клеток расконсервировалась путем высева на жидкую питательную среду и выращивалась в течение 3 суток в термостате при 30 С.
После этого суспензия выросших клеток разводилась водой и высевалась на чашки Петри с плотной (агаризированной) средой для получения отдельных клонов. После 3 суток выращивания отдельные красные клоны отбирались и высевались на чашки Петри со специальной средой для выявления частоты спонтанных мутаций.
Клетки из клонов, дающих частоту спонтанных мутаций (1-3)х10 далее использовались в работе.
Облучение ультрафиолетовыми лучами (УФ-лучи). Применяли лампу БУВ-30П с мощностью дозы на используемом уровне - 0,26 Дж/м сек. Суспензия дрожжевой культуры в дистилированной воде с 7 концентрацией 10 клеток/мл в количестве 4 мл наливалась в стерильные чашки Петри и облучалась УФ-лучами в требуемой дозе.
Немедленно после облучения исходная суспензия клеток разводилась с таким расчетом, чтобы на чашках вырастало для учета выживаемости не более 500 клонов, а для учета мутагенеза
1000-1500 колоний. Рассев производили на среду, состав которой описан выше. Учет мутантов производили на 6-7 сутки инкубации под бинокуляром (увеличение в 15 раз).

ИСПЫТАНИЕ ПРЕПАРАТА «Гептронг» НА АНТИМУТАГЕННУЮ АКТИВНОСТЬ.
Культура тестерного штамма суспензировалась в воде до концентрации 107 клеток/мл. Контролем служила суспензия клеток, полученная смешиванием 0,7 мл исходной суспензии с 0,3 мл дистиллированной воды. В опыте 0,7 мл водной суспензии облученных определенной дозой УФ-лучей клеток тестерной линии смешивали с 0,3 мл испытуемого препарата. После этого делаются соответствующие разведения и высев
клеток на плотную питательную среду.
Эксперименты по спонтанному мутагенезу.
Штамм hsm3 pol2
Проведено 10 независимых опытов.
Средние величины спонтанного мутагенеза для:
Контроль: (1.08 ±0.02) х 10-8
Гептронг: (0.18 ±0.02) х 10-8
Как и ожидалось, антимутагенный эффект при спонтанном мутагенезе очень большой.


Директор ОМРБ ПИЯФ д.б.н. В.Г.Королев